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EZB彩色qPCR試劑盒是專為多重實時熒光定量PCR設計的全預混體系，包含優化濃度的ROX2被動參比染料，適配ABI 7500、Bio-Rad CFX96等多品牌qPCR儀。核心優勢包括：
·2×預混Master Mix：整合HotStart Taq酶、dNTPs及反應緩沖液
·高兼容性：支持SYBR Green I、EvaGreen及TaqMan探針檢測
·擴增效率：標準曲線顯示≥98%擴增效率(R²值>0.99)
貨號：A0012-R2
包裝規格：1 mL(50次反應) / 5 mL(250次反應)
ROX濃度：預混0.3X ROX2(適配多數機型光學校準需求)
適用樣本：DNA(≥1 ng/μL)、cDNA(稀釋比1:5-1:20)
保存條件：-20℃避光保存(避免反復凍融>5次)
有效期：生產日期起18個月
1. 反應體系配置
| 組分 | 體積（μL） |
| 2× qPCR Master Mix | 10 |
| 正向引物（10 μM） | 0.4 |
| 反向引物（10 μM） | 0.4 |
| 模板DNA | 1-5 |
| ddH?O | 補至20 |
2. 程序設置（兩步驟法）
①預變性：95℃ 3分鐘（激活HotStart酶）
②循環階段（40 Cycles）：
·95℃ 15秒（變性）
·60℃ 30秒（退火/延伸，FAM通道采集熒光）
③熔解曲線（選做）：
65℃→95℃，每0.5℃遞增，駐留5秒
3. 數據判讀
·Ct值閾：建議設置于熒光信號指數增長1/3處
·熔解曲線：單峰提示特異性擴增（Tm值波動≤1.5℃為正常）
1. 基因組DNA定量（人類GAPDH基因）
·模板量：10 ng DNA
·引物濃度：0.2 μM
·結果判讀：Ct值＜28（3次重復CV≤1.5%）
2. 病毒RNA檢測（甲流H1N1）
·反轉錄整合：直接使用cDNA（試劑盒兼容預混RT-qPCR體系）
·探針濃度：TaqMan探針0.5 μM
·靈敏度：檢測下限達10 copies/μL
3. 細菌表達分析（大腸桿菌16S rRNA）
·抑制劑處理：添加1% BSA消除腐殖酸干擾
·梯度稀釋：標準曲線R²值需≥0.995
| 問題現象 | 潛在原因 | 解決方案 |
| 擴增曲線平臺期低 | 模板降解或引物二聚體 | 更換新批次引物 + DNase處理模板 |
| 陰性對照出現Ct值 | 氣溶膠污染 | 啟用UNG防污染系統（貨號A0021） |
| 熔解曲線出現多峰 | 非特異性擴增 | 提升退火溫度至62℃，縮短延伸時間 |
| ROX校正信號異常 | 分裝凍融次數過多 | 新解凍試劑 + 校準儀器光路 |
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